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1. 綜述了FLIM聯(lián)合NAD(P)H、FRET和生物傳感器在癌癥診斷和治療監(jiān)測(cè)的應(yīng)用。

2. 介紹了FLIM的原理及其臨床轉(zhuǎn)化發(fā)展歷程。

3. 討論了FLIM技術(shù)的不足及未來在癌癥診斷和抗癌治療的應(yīng)用發(fā)展前景。

內(nèi)容簡介

時(shí)間分辨熒光成像顯微鏡(FLIM)在過去的30年里得到了迅速的發(fā)展，并在生物醫(yī)學(xué)工程中得到了廣泛的應(yīng)用。熒光標(biāo)記探針設(shè)計(jì)的最新進(jìn)展進(jìn)一步拓寬了熒光的應(yīng)用前景。由于熒光時(shí)間對(duì)微環(huán)境和分子層面改變更加敏感，故FLIM對(duì)疾病的診斷和療效評(píng)估極具應(yīng)用前景。

目前癌癥相關(guān)的FLIM應(yīng)用可分為三大類：(i) FLIM檢測(cè)以NAD(P)H為代表的胞內(nèi)或胞外的自發(fā)熒光分子用于細(xì)胞代謝研究；(ii) FLIM結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移用于蛋白質(zhì)相互作用監(jiān)測(cè)；(iii) FLIM結(jié)合熒光標(biāo)記的生物傳感器進(jìn)行癌癥異常分子檢測(cè)。納米材料和熒光時(shí)間快速計(jì)算技術(shù)的進(jìn)展，以及新的癌癥生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了FLIM的優(yōu)化，為癌癥診斷和治療的醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供了更多的機(jī)會(huì)。

中南大學(xué)劉艷平教授，武明花教授；澳洲悉尼大學(xué)Zongwen Liu副教授等在本文中綜述了2015-2020年癌癥相關(guān)FLIM應(yīng)用的前沿研究，討論了FLIM在未來癌癥診斷和抗癌治療的可能性，同時(shí)總結(jié)了當(dāng)今FLIM發(fā)展的不足以及未來在癌癥領(lǐng)域的發(fā)展方向。

圖文導(dǎo)讀

I FLIM臨床應(yīng)用發(fā)展

熒光時(shí)間憑借其對(duì)微環(huán)境改變敏感等諸多優(yōu)勢(shì)在熒光成像領(lǐng)域得到了越來越多的應(yīng)用，時(shí)間分辨熒光技術(shù)(FLIM)也隨之發(fā)展。自上個(gè)世紀(jì)八十年代，第一臺(tái)單分子計(jì)數(shù)-時(shí)間分辨熒光技術(shù)(TCSPC-FLIM)被發(fā)明以來，在FLIM成像速度，熒光時(shí)間測(cè)量準(zhǔn)確性，分辨率等方面，F(xiàn)LIM得到了長足的發(fā)展，如雙光子和多光子熒光FLIM技術(shù)不但在實(shí)驗(yàn)室層面得到了發(fā)展，也有越來越多的臨床FLIM器械得到研制并逐步走向臨床應(yīng)用。而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，F(xiàn)LIM也在胞內(nèi)離子濃度，蛋白相互作用，皮膚病等多個(gè)領(lǐng)域具有發(fā)展?jié)摿Γ�本文則是基于當(dāng)前癌癥高發(fā)生率和死亡率的現(xiàn)狀，從NAD(P)H自發(fā)熒光，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)以及生物傳感器三個(gè)方面系統(tǒng)論述了近五年FLIM在癌癥早期診斷和療效監(jiān)測(cè)上的應(yīng)用。

II FLIM的基本原理

如圖2a所示，當(dāng)分子被激發(fā)至激發(fā)態(tài)后，它將返回到基態(tài)，而熒光正是分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的一種能量輻射形式。熒光壽命可以被簡單地理解成一個(gè)物質(zhì)中所有分子在激發(fā)態(tài)平均的“停留時(shí)間”，也可以經(jīng)過精準(zhǔn)的熒光強(qiáng)度衰減曲線記錄，將熒光強(qiáng)度從I₀衰減到I₀/e的時(shí)間視為熒光壽命。 而在時(shí)間分辨熒光顯微鏡(FLIM)的構(gòu)造方面，圖2b介紹了FLIM是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)框架上融合單光子檢測(cè)器和光子計(jì)時(shí)裝置而進(jìn)行研發(fā)。基于熒光時(shí)間的測(cè)量方式，F(xiàn)LIM可以分為時(shí)域和頻域兩類，時(shí)域中又可分為TCSPC，時(shí)間門控和條紋相機(jī)三大類，其中TCSPC-FLIM的基本原理如圖2c的示例圖所示，通過光電倍增管的信號(hào)放大以及時(shí)幅、幅電轉(zhuǎn)換將不同時(shí)刻檢測(cè)到的光子依據(jù)到達(dá)時(shí)間構(gòu)建熒光強(qiáng)度衰減曲線從而得到熒光時(shí)間。而頻域FLIM的基本原理則是如圖2d所示，基于對(duì)激發(fā)光的調(diào)制和檢測(cè)信號(hào)的解調(diào)，利用對(duì)曲線相移等參數(shù)分析，獲得熒光時(shí)間。經(jīng)過儀器測(cè)得的熒光衰減曲線，依據(jù)熒光來源于單個(gè)或多個(gè)熒光分子的區(qū)別可以通過單指數(shù)或多指數(shù)函數(shù)分析計(jì)算來分析得到熒光時(shí)間。為了規(guī)避上述兩種方法需要提前判斷熒光分子數(shù)目和精確擬合熒光衰減曲線的缺點(diǎn)，相量分析在熒光時(shí)間的分析領(lǐng)域方面得到了越來越多的應(yīng)用。利用公式將FLIM儀器所測(cè)得的參數(shù)值轉(zhuǎn)換成繪制相量圖(Phasor Plot)所需的g值和s值，對(duì)得到的相量圖進(jìn)行進(jìn)一步的分析獲得檢測(cè)樣品中熒光分子數(shù)目及各自的熒光時(shí)間等信息，并可以此為基礎(chǔ)繪制FLIM圖像。

III FLIM結(jié)合NAD(P)H分子的自發(fā)熒光用于癌細(xì)胞代謝監(jiān)測(cè)

基于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)(NADH，NADPH)和氧化型黃嘌呤二核苷酸(FAD)的自發(fā)熒光特性，以及如圖3b所示的在細(xì)胞糖酵解和三羧酸循環(huán)過程以及后續(xù)氧化磷酸化(OXPHOS)過程中NADH、FAD等分子的變化，利用FLIM檢測(cè)這些自發(fā)熒光分子熒光時(shí)間的變化可以實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞胞內(nèi)代謝的監(jiān)測(cè)。而在這個(gè)部分，依據(jù)直接檢測(cè)參數(shù)的不同，又可以分為熒光時(shí)間、比值和相量圖以及多參數(shù)FLIM三個(gè)部分。

在熒光時(shí)間部分，值得先說明的是，在氧化磷酸化過程中由于NADH分子會(huì)與輔酶結(jié)合而呈現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)合NADH狀態(tài)，NADH分子的熒光時(shí)間將會(huì)從0.4 ns增長至2 ns。而上個(gè)世紀(jì)由Warburg提出的Warburg效應(yīng)又指出癌細(xì)胞較正常組織細(xì)胞更喜歡在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)利用糖酵解進(jìn)行能量供應(yīng)同時(shí)抑制通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，故癌細(xì)胞中的熒光時(shí)間往往短于正常組織細(xì)胞，利用這一特性可以實(shí)現(xiàn)如圖3a-i所示的腫瘤手術(shù)切除邊緣的確定。但最近也有越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，以腫瘤干細(xì)胞為代表的腫瘤細(xì)胞并不遵守Warburg效應(yīng)，具體原因還有待探究。

而比值和矢量圖部分則是基于代謝過程中這些自發(fā)熒光分子形式的變化，利用比值放大代謝發(fā)生前后差異，達(dá)到靈敏檢測(cè)的目的。如圖3a-iii所示，利用糖酵解過程中增高的NADH/NAD+比值和腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)原理，可以幫助確定腫瘤手術(shù)切除邊緣。而相量圖則是通過多種自發(fā)熒光分子如彈性蛋白(elastin)，F(xiàn)AD，尤其是游離型和蛋白結(jié)合型NADH在代謝過程中的改變導(dǎo)致的熒光時(shí)間變化(圖4a)，反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)free-NADH/bound-NADH的比值變化，實(shí)現(xiàn)在宮頸癌癌前病變(圖3a-ii)、白血病細(xì)胞亞型分類(圖4b)等多個(gè)臨床領(lǐng)域的應(yīng)用。

在多參數(shù)FLIM領(lǐng)域內(nèi)，多光譜FLIM(ms-FLIM)用于癌癥的診斷往往集中在口腔癌前病變(圖3a-iv)以及皮膚基底細(xì)胞癌等領(lǐng)域。同時(shí)，利用計(jì)算機(jī)對(duì)以高斯分布、信息熵以及熒光時(shí)間的分析處理，包含熒光時(shí)間的多參數(shù)分析處理模型也有望輔助臨床上以基底細(xì)胞癌診斷為代表的多種皮膚疾病的診斷分型(圖4c)。

IV FLIM結(jié)合熒光共振能量(FRET)技術(shù)的應(yīng)用

如圖5a所示，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)發(fā)生在特定條件下的供體和受體熒光分子之間，利用全反射熒光顯微鏡(TIRF)或者時(shí)間分辨熒光顯微鏡(FLIM)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)FRET效率或者供體熒光分子熒光時(shí)間衰減的檢測(cè)。FRET-FLIM在癌癥領(lǐng)域的檢測(cè)應(yīng)用依據(jù)采取的FRET熒光對(duì)的不同類型可以分為五類，熒光對(duì)裂解型(cleavage)，結(jié)合域型(Binding domain)，蛋白熒光分子標(biāo)記型(Tag)，二聚物型(Dimer)和底物分子反應(yīng)型(Substrate)。熒光對(duì)裂解型主要針對(duì)產(chǎn)生切割效應(yīng)的蛋白質(zhì)的活性檢測(cè)，如圖5b中所示的caspase3的活性檢測(cè)。Binding domain型則往往是利用靶標(biāo)分子與不同底物結(jié)合時(shí)的構(gòu)象差異導(dǎo)致的FRET發(fā)生與否的后果，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)蛋白的活性檢測(cè)，如圖5c中所示的RhoA蛋白。利用Tag型則是基于靶標(biāo)蛋白構(gòu)象改變導(dǎo)致相連的FRET熒光對(duì)的FRET現(xiàn)象變化來實(shí)現(xiàn)活性的間接檢測(cè)，圖5d針對(duì)的目標(biāo)即是PKB蛋白活性檢測(cè)。至于Dimer型熒光分子對(duì)結(jié)合FLIM的應(yīng)用多見于在細(xì)胞膜或外泌體上會(huì)發(fā)生二聚化的受體數(shù)量或活性檢測(cè)，如表皮生長因子受體家族HER2，HER3受體就是研究的代表(圖5e)。最后一類底物型基本模式與Tag型很接近，兩者的最大區(qū)別在于Tag型是靶標(biāo)蛋白自身被激活導(dǎo)致的自身構(gòu)象改變使得FRET效應(yīng)發(fā)生變化，而底物型的靶標(biāo)蛋白是通過使它的目標(biāo)底物發(fā)生構(gòu)象變化，而達(dá)到目標(biāo)底物上相連的FRET熒光對(duì)的FRET變化，以進(jìn)行活性檢測(cè)(圖5f)。通過對(duì)胞內(nèi)或膜上蛋白質(zhì)數(shù)量或者活性的改變從分子水平上達(dá)到癌癥診斷或者抗癌治療療效評(píng)估的目的，提升癌癥患者的預(yù)后。

V FLIM結(jié)合熒光標(biāo)記探針的應(yīng)用

5.1 胞內(nèi)分子變化FLIM檢測(cè)

細(xì)胞內(nèi)的分子變化FLIM檢測(cè)可以分為核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)兩類，在細(xì)胞核內(nèi)部分圖6a論述的是結(jié)合一種乙酰轉(zhuǎn)移酶活性生物傳感器(HATS)實(shí)現(xiàn)對(duì)乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的檢測(cè)從而輔助針對(duì)組蛋白乙�；�的抗癌藥物療效評(píng)估。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，F(xiàn)LIM則可以結(jié)合新型量子點(diǎn)和熒光標(biāo)記的香豆素探針實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)兩大代謝情況-糖代謝和脂代謝的監(jiān)測(cè)，輔助癌細(xì)胞的代謝研究和臨床診治應(yīng)用(圖6a，c)。

5.2 膜結(jié)構(gòu)變化FLIM檢測(cè)

由于FLIM檢測(cè)膜上受體變化情況已在FLIM-FRET部分詳細(xì)論述，在這一部分主要聚焦于FLIM結(jié)合熒光探針檢測(cè)細(xì)胞膜和線粒體膜的電勢(shì)以及膜黏度變化的應(yīng)用。這些參數(shù)與細(xì)胞膜通透性等指標(biāo)相關(guān)，間接反映細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等細(xì)胞活動(dòng)。在膜電勢(shì)測(cè)量領(lǐng)域，圖7a選擇的代表性研究是利用FLIM檢測(cè)VoltageFluor熒光染料標(biāo)記探針的熒光時(shí)間，由于膜去極化時(shí)削弱了光誘發(fā)的電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致從超極化到去極化時(shí)檢測(cè)到的熒光時(shí)間將會(huì)延長。而在膜黏度測(cè)量領(lǐng)域，熒光探針大多基于圖7b左圖所示的氯化硼絡(luò)合二吡絡(luò)甲川結(jié)構(gòu)(BODIPY)。如圖7b右圖所示，當(dāng)膜黏度升高時(shí)將會(huì)提升從熒光探針從平面構(gòu)型轉(zhuǎn)換到蝶式構(gòu)型的能量壁壘，導(dǎo)致激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的非輻射性途徑削弱，從而使得以熒光為代表的能量輻射途徑增強(qiáng)，熒光時(shí)間延長。圖7c即是使用BODIPY2探針結(jié)合FLIM實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)CT26腫瘤的FLIM成像，檢測(cè)細(xì)胞膜黏度。

5.3 腫瘤細(xì)胞外環(huán)境FLIM檢測(cè)

在腫瘤細(xì)胞外環(huán)境中，主要討論了結(jié)合熒光探針、量子點(diǎn)等熒光材料是否有望實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤微環(huán)境的pH，血管構(gòu)成以及外泌體進(jìn)行檢測(cè)。使用融合有ECFP熒光蛋白的CBD-ECFP分子可以實(shí)現(xiàn)利用熒光時(shí)間反映體外基質(zhì)中pH的目的(圖8a)。而腫瘤血管成像則是基于血液中循環(huán)的量子點(diǎn)的長時(shí)熒光特性，探究腫瘤組織和正常組織血管形態(tài)差異(圖8b)。而圖8c則是利用膜黏度探針的熒光時(shí)間反映外泌體的膜黏度從而得到外泌體大小的信息，有望用于臨床癌癥早期診斷。

5.4 FLIM檢測(cè)具有熒光發(fā)射的抗癌藥物遞送

圖9a是利用FLIM探究帶有OG熒光標(biāo)記的外泌體和微囊泡紫杉醇遞藥方式入胞機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)外泌體主要通過胞吞方式入胞，而微囊泡則通過胞吞和與細(xì)胞膜融合兩種方式入胞。而在脂質(zhì)體遞藥策略(liposome)研究中，圖9b的研究中使用FLIM探究了體內(nèi)遞送過程中生物分子冠狀物在脂質(zhì)體周圍形成導(dǎo)致載藥泄露的問題。除了前面兩類抗癌藥物遞送策略，近年來以納米結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的抗癌藥物遞送新策略不斷涌現(xiàn)，一種如圖9c所示的PAH-Cit-Dox的納米遞送策略得到了構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)室研究，使用FLIM得到FLIM相量圖(Phasor plot)和相量區(qū)分的熒光時(shí)間像素圖(PDLPI)對(duì)阿霉素的釋放和其在細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，輔助遞送策略優(yōu)化和療效提升。

VI總結(jié)與展望

1. FLIM成像速度，分辨率提升以及與其它光學(xué)技術(shù)的整合成像。

2. FLIM走向臨床應(yīng)用在熒光分子生物相容性、靶向性，以及深層次穿透能力如近紅外熒光分子研究仍需進(jìn)行。

3. FLIM結(jié)合NAD(P)H自發(fā)熒光用于代謝檢測(cè)可以拓寬至腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、神經(jīng)元等，輔助腫瘤免疫治療等研究。

4. 利用熒光探針結(jié)合FLIM有望實(shí)現(xiàn)腫瘤外泌體中RNA檢測(cè)，而以阿霉素(Dox)為代表的抗癌藥物遞送也可與外泌體策略結(jié)合，使用FLIM監(jiān)測(cè)優(yōu)化。